Biologia AR Szczecin

Kultury tkankowe i komórkowe in vitro zwierząt

Ćwiczenie 3
Hodowle płynne – wprowadzenie.
Przygotowanie roztworu fazeoliny LF-7.
Założenie hodowli limfocytów.


1.    Hodowle z zawiesinie.

Hodowle w zawiesinie (hodowle płynne) zakłada się w naczyniach ze stałym mieszaniem (z określoną prędkością 30-100 obr./min., czyli taką, która nie uszkodzi poddanych hodowli komórek) w celu zapobieżenia opadania komórek na dno naczynia i napowietrzania hodowli. Porównując hodowle komórek rosnących w jednej warstwie i hodowli w zawiesinie, jedną z charakterystycznych cech jest redukcja powierzchni i ilości pożywki na korzyść hodowli w zawiesinie. Mimo tak korzystnych walorów, hodowla taka wykorzystywana jest w stosunku do niewielkiej ilość komórek przejawiających zdolność do wzrostu w zawiesinie. Komórkami hodowanymi w ten sposób są limfocyty T, chondrocyty oraz niektóre linie komórek białaczkowych lub odpowiednio wyselekcjonowanych komórek nowotworowych, jak na przykład spontanicznie stransformowanej linii komórkowej HeLa. W przypadku hodowli w zawiesinie pożywki tu stosowane często wymagają modyfikacji, np. obniżenia zawartości jonów wapnia w celu uniknięcia tworzenia się agregatów i przyklejania komórek do ścian naczynia. Wydajność hodowli w zawiesinie definiowana jest  jako liczba komórek możliwych do uzyskania przy użyciu określonej objętości pożywki i jest znacznie większa, niż w przypadku hodowli jednowarstwowej.

2.    Hodowla limfocytów.

Hodowla limfocytów jest szczególnym rodzajem hodowli. Komórki w niej hodowane słabo przylegają do podłoża i dlatego przeważnie hoduje się je w niewielkich buteleczkach, w których gromadzą się na dnie, ale nie ulegają rozpłaszczeniu na nim. Wzrost limfocytów możliwy jest dzięki substancjom o charakterze lektyn, które pobudzają przekształcenie się limfocytów w komórki blastyczne, a następnie ich podziały mitotyczne. Lektyny są białkami lub glikoproteinami wybiórczo wiążącymi w sposób nieezymatyczny węglowodany glikoprotein i glikolipidów powierzchniowych komórek. Wzrost komórek możliwy jest właśnie dzięki lektynom, które działają pobudzająco na przekształcanie się limfocytów w komórki blastyczne, a następnie ich podział. Pobudzenie limfocytów T przez mitogeny wzmagają na ogół, tak zwane komórki dodatkowe. Prezentują one w pewien sposób mitogeny limfocytom T, a także dostarczają im zarazem innych dodatkowych sygnałów, np. IL-1, IL-6.
Jedną z lektyn jest fazeolina inaczej fitohemaglutynina. Jest ona białkiem wyodrębnionym z nasion strączkowych fasoli (Phaseolus vulgaris). Białko to po oczyszczeniu składa się z dwóch frakcji PHA-P (protein rich) i PHA-M (mucoprotein rich). Wywołują one aglutynacje erytrocytów u niektórych gatunków zwierząt (poprzez wiązanie fragmentów polisacharydowych błon komórek z aktywnym centrum lektyny), a formie rozpuszczalnej są silnym mitogenem limfocytów T. Działanie tego mitogenu wywołuje transformacje blastyczną. Polega ona na aktywacji małych (spoczynkowych) limfocytów, co objawia się przejściem komórki z fazy G0 w fazę G1. Komórki podlegają transformacji morfologicznej – zwiększają swoje rozmiary i jądra, następuje uwidocznienie jąderek. Następnie obserwowana jest synteza RNA i początek syntezy DNA. Komórki stają się zdolne do podziałów. Transformacja blastyczna zachodzi poprzez zdolność wiązania fazeoliny przez receptor TCR limfocytów T. Innymi mitogenami limfocytów T są konkanawalina A (Con A), kandydyna, mitogen szkarłatki amerykańskiej (PWM), ester forbolu (PMA).
Znane są tez mitogeny indukujące transformacje  limfocytów B, wśród nich występują mitogen szkarłatki amerykańskiej (mitogen nieswoisty antygenowo), lipopolisacharydy (LPS), surowica antyimmunoglobulinowa.
Fitohemaglutynina jest również określana jako induktor interferonu. Obok PHA znanymi induktorami mogą być wirusy, bakterie gram ujemne, pierwotniaki.
Stymulując limfocyty mitogenami można łatwo uzyskać dużą liczbę dzielących się komórek, co może być wykorzystywane w różnych badaniach. Jednym z takich badań jest rutynowa ocena kariotypu do czego wykorzystuje się limfocyty krwi obwodowej (prenatalne badania wykonuje się na amniocytach lub komórkach trofoblastu) co jest szczególnie przydatne w diagnostyce cytogenetycznej przy ustalaniu aberracji chromosomowych. A także oznaczenie uszkodzeń DNA metodą kometkową – metoda ta polega na elektroforezie żelowej pojedynczych komórek i oznaczaniu ilości DNA w „ogonie kometki”. Stosując odpowiednie enzymy, można nią również oznaczyć określone uszkodzenia zasad azotowych DNA, np. uszkodzenia oksydacyjne. Hodowle limfocytów wykorzystywane są również przy określaniu zgodności tkankowej pomiędzy osobnikami tego samego gatunku i wykrywaniu uczuleń chorych na rozmaite antygeny.



1. Założenie hodowli limfocytów izolowanych z wykorzystaniem Biocoll’u:

Izolacja limfocytów:

1. Do probówki wlewany 7 ml Biocoll’u.
2. Mieszamy równe objętości krwi pełnej i medium hodowlanego, a następnie przenosimy na Biocoll.
3. Wirujemy  1200 g przez 20 min.
4. Zbieramy warstwę zawierającą limfocyty (warstwa pomiędzy) i płuczemy w medium hodowlanym.
5. Wirujemy  10 min/300g.
6. 10 min/200g.


2. Założenie hodowli limfocytów z krwi pełnej:


Przygotowanie roztwory fazeoliny LF-7:

Do naczynia hodowlanego przenieść zawartość ampułki (LF-7).
Rozpuścić w 1 ml sterylnej wody destylowanej.
Dodać 6 ml płynu Hanksa.

Przygotowanie płynu hodowlanego i założenie hodowli płynnej:


Do każdego naczynia hodowlanego dodać:
-    4 ml medium RPMI 1640
-    1 ml surowicy płodowej FSC
-    0,15 ml roztworu fazeoliny
-    0,1 ml mieszaniny antybiotyków penicylina-streptomycyna
-    0,5 ml pełnej krwi

Zamknąć naczynia hodowlane parafilmem lekko opalonym nad palnikiem.
Wstawić naczynia hodowlane do cieplarki – 39 st. C.

Tempo wzrostu komórek może być różne. Często pierwsze sygnały wzrostu są widoczne po kilkudziesięciu godzinach, jednak najczęściej wzrost widoczny jest dopiero po kilku dniach (48, 72 bądź 96h).

wejściówki nie bedzie nic nie mówiła więc niech nawet nie wyskakuje:)  wtedy jak nie bylo pradu to mówiła ze maja byc praktyczne:) takze nie ma co sie stresowac:)

to z tego konspektu bedzie teraz we wtorek 6go wejsciowka z in vitro .